L’interno corrisponde alla basilica consacrata nel 1116 da Pasquale II. È una chiesa a tre navate conclusa da un alto transetto, le navate laterali sono dotate di matronei. Le colonne e i capitelli provengono da antichi monumenti della Roma imperiale.
Il pavimento, a parte alcuni restauri, è quello originale in stile cosmatesco; è caratterizzato da una successione di rotae, ovvero di grandi dischi di marmo e porfido, e pannelli di mosaici formati da marmi antichi riutilizzati; il nome “cosmatesco” deriva da una famiglia di scultori architetti operanti a Roma fra il XII e il XIII secolo.
Il soffitto è a cassettoni di legno e riporta inciso lo stemma del re del Portogallo Enrico (1547-1580) che fu cardinale titolare della basilica. Lungo le pareti delle navate si conservano frammenti di affreschi medievali e si possono osservare le antiche colonne della chiesa altomedievale tamponate all’epoca della costruzione della basilica pascaliana. Nella navata destra si trova il cinquecentesco altare del Presepe con la pala raffigurante il Mistero della Natività di Gesù di ambito zuccaresco (1585 c.); segue il monumento funebre (con urna e busto del defunto) di Luigi d’Aquino (morto nel 1679), uditore della Camera Apostolica. Sul pilone destro dell’arco trionfale si trova l’altare della Crocifissione con affresco seicentesco raffigurante il supplizio di Gesù Cristo.
Nella navata sinistra si nota l’altare dell’Annunciazione con affreschi di Giovanni da san Giovanni (1623-1624); una grata posta al di sopra dell’altare permetteva alle monache, senza dover uscire dalla clausura, di venerare l’altare del Presepe che si trovava sul lato opposto. Segue il venerato altare di S. Sebastiano che un tempo conservava, all’interno di una nicchia protetta da una grata dorata, il capo del martire (ora le reliquie sono conservate a S. Pietro).
Sopra la nicchia, la pala raffigurante San Sebastiano curato da Lucina e Irene è opera di Giovanni Baglione (1571-1644). Sul pilastro sinistro dell’arco trionfale si trova l’altare dei Ss. Pietro e Paolo con pregevole tabernacolo di marmo attribuito ad Andrea Bregno del tempo di Innocenzo VIII (1484-1492).
La sistemazione del presbiterio risale ai lavori del cardinale Mellini tra il 1621 e il 1624. Egli fece ricostruire il tetto, risistemare la cattedra cardinalizia e la balaustra; fece inoltre lo scavo nella sottostante cripta alla ricerca delle reliquie dei santi titolari. Il cardinale commissionò al pittore fiorentino Giovanni da San Giovanni (1592-1636) i sontuosi affreschi con la storia dei Coronati (sia gli scalpellini della Pannonia sia i soldati romani) che decorano l’abside e quelli della volta che raffigurano la Gloria di tutti i Santi.